做了 5 年的 MTT 實驗 ，耗費了上萬塊 96 孔板。有成功的喜悅，有失敗的沮喪，有好多話要對各位實驗同仁說。在這之前，我們先回顧一下 MTT 的原理及操作步驟。

實驗原理

       MTT 是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下，生成藍色的 formazan 結晶。formazan 結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原，無法形成結晶），且該結晶溶解于 DMSO。利用酶標儀測定波長 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細胞數目。

實驗步驟

1. 接種細胞：用含 10% 胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔合適的細胞數量接種到 96 孔板，每孔體積 180 ul。

2. 培養細胞：同一般培養條件，可根據試驗目的和要求決定培養時間。

3. 呈色：每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 緩沖液 pH=7.4 配制）20 ul。繼續孵育 4 小時，終止培養，小心棄去孔內培養上清液，對于懸浮細胞，需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩 10 分鐘，使結晶物充分融解。

4. 比色：選擇 490 nm 波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

個人心得體會

1. 細胞消化、接種數量：注意消化和數量，消化和數量，消化和數量（重要的事情說三遍）。從我個人的實驗經驗來看，這是重中之重。

若消化出現問題，則會影響細胞的活性，進而影響 OD 值。對于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的細胞，消化時胰蛋白酶中不添加 EDTA，消化時也僅需胰酶浸潤數秒即可。

然而，對于 SW480 等一系列難以消化的細胞，胰蛋白酶中需添加濃度為 0.25% 的 EDTA。對于細胞接種數量要適宜，過小或過大均會影響 OD 值（過小細胞容易死亡，過大細胞容易生長擁擠）。

我做過的幾種常見細胞的每孔接種數量如下（個人經驗）：

2. 培養液的棄去及 DMSO 溶解：一般大家喜歡用移液器吸取孔內培養液，吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取，不要觸碰底部的紫色結晶。我喜歡將 96 孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內的培養液。兩種方法效果差不多，大家根據個人喜好選擇。

加入 DMSO 溶解后，我喜歡將加入 DMSO 的 96 孔板放入 37 ℃ 孵箱內孵育 10～20 min，這樣有助于 DMSO 對紫色結晶物的溶解（尤其在冬天）。

以下是我在去年 12 月的一些結果（某種藥物的細胞毒性實驗，綠色為 control 組，紅色為加藥組）。下圖結果顯示，若不 37 ℃ 孵育，紫色結晶溶解不充分，造成 OD 值偏小（細胞毒性實驗時，control 組的 OD 值zui佳范圍為 0.5-0.7）。

加入 DMSO 后，37 ℃ 孵育 15 min，振蕩 10 min。

無孵育，加入 DMSO 后振蕩 10 min。