前期準備

在經過前期與馬同學的討論后，決定在這次測試中，對原 protocol 進行如下重大調整：

1. 測試時增加陽性/陰性對照片（Control slides：SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls #13747），確保抗體和染色結果的特異性；

2. 將高壓修復法調整為微波修復法；

3. 使用 CST 的 EDTA 修復液；根據 CST 的 protocol，增加修復液的用量（適用組化修復缸，用量為200 mL/次），且修復后不冷卻切片；

4. 使用全套 CST 輔助試劑，即 ImmunohistochemistryApplication Solutions Kit (Rabbit) #13079，確保體系的穩定性。

(左) CST技術人員與馬同學共同討論實驗。(右)本次實驗使用的修復缸

實驗步驟

脫蠟與水化

1. 二甲苯脫蠟：3 × 5 min。（為確保測試時二甲苯新鮮，使用新的二甲苯）

2. 乙醇水化：100% 乙醇2 × 10 min；95% 乙醇，2 × 10 min。

3. 洗滌：切片浸沒于ddH2O中，3 ×5 min。

抗原修復

4. 修復：使用200 mL ddH2O稀釋后的SignalStain^? EDTA Unmasking Solution#14747進行修復，根據實驗室微波爐的實際情況，高火檔加熱2 min45sec后煮沸，立即換保溫檔，保溫15 min。修復后切片不冷卻，直接進行下一步。

5. 洗滌：切片浸沒于dH2O中，3 ×5 min。

去除內源性過氧化物酶

6. 3% 過氧化氫處理切片，加蓋室溫放置15 min。（加蓋的目的是為了防止過氧化氫與空氣接觸后并不穩定）

7. 洗滌：切片浸沒于dH2O中，2 ×5 min。

8. 緩沖液轉換：切片浸沒于TBST中，1 ×5 min。

封閉與一抗孵育

9. 配置封閉液（Animal-Free Blocking Solution #15019），滴加在切片上，室溫靜置1 h。（此步建議一張張完成，防止干片）

10. 配置一抗：使用SignalStain^? Antibody Diluent #8112 稀釋PD-L2抗體（#82723）稀釋度為1：200。

11. 橫瀝封閉液，用衛生紙盡量吸干封閉液后，將一抗滴加在切片上。（此步建議一張張完成，防止干片）

12. 將濕盒小心移入4度冰箱，過夜。

CST技術人員正在配置和滴加抗體

二抗孵育與顯色

13. 小心取出濕盒，在室溫平衡45分鐘左右。

14. 洗滌：切片浸沒于TBST中，3 ×5 min。

15. 將二抗SignalStain^? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)#8114 滴加于切片上，室溫孵育40 min。

16. 洗滌：切片浸沒于TBST中，3 ×5 min。

17. 配置顯色液：將一滴SignalStain^? DAB Chromogen Concentrate（約30ul）加入1 mL SignalStain^? DAB Diluent中，混勻。

18. 將顯色液滴加于切片上，于顯微鏡（10倍目鏡）下觀察染色情況，待看到棕黃色陽性沉積，且背景不深時，將切片浸沒于ddH2O中，終止染色。

19. 按實驗室常規步驟復染核、封片。

測試結果

使用PD-L2的陽性對照切片SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls #13747，在陽性細胞團中見到陽性染色，在陰性細胞團中未見染色，提示抗體適用于石蠟切片，且特異性佳。

使用PD-L2(D7U8C^TM ) XP^? RabbitmAb( #82723)在對照切片SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls（#13747）上的HDLM-2陽性細胞團（左）和PC-3陰性細胞團（右）進行免疫組化染色

在馬同學的人淋巴結石蠟切片上，也觀察到了陽性染色。

使用 PD-L2(D7U8C^TM) XP^? RabbitmAb( #82723)在客戶提供的人淋巴結石蠟切片上進行免疫組化染色

編后記

科研實驗向來不是「躺贏局」，必須是「盡力局」：Victory 固然好，Defeat 也不用氣餒，分析戰后數據，調整實驗方案和策略，下一次「匹配」開始后又是一場全新的戰斗。