工作液配制：

配制100ml的modified RIPA buffe：

1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4

2. 加10 ml 10%的NP-40

3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會(huì)降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。

各種成分在工作液中的終濃度：

* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

* NP-40: 1%

* 去氧膽酸鈉：0.25%

* NaCl: 150 mM

* EDTA: 1 mM

* PMSF: 1 mM

* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 μg/ml

* Na3VO4: 1 mM

* NaF: 1 mM

三、實(shí)驗(yàn)流程為：

（1）轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；

（3）取10μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；

（4）將預(yù)處理過(guò)的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；

（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。

2．將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4℃以最大速度離心15 min。

3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當(dāng)抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h。

4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。

7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過(guò)夜。

8．通過(guò)考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。

9．從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。

10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。

11． 通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測(cè)序。

四、注意的問(wèn)題：

（1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。

（2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用

（3）使用對(duì)照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

(1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；

(2) 要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；

(3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。