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產(chǎn)品名稱:

附睪分泌蛋白4抗體

 
產(chǎn)品編號: YH5845 
附睪分泌蛋白4抗體
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抗體標記簡介:
抗體標記是指將標記物(酶,熒光素,生物素等)共價連接到抗體上,與待檢測物(如某些特定抗原)特異性反應(yīng)形成多元復(fù)合物,并借助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器對試驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定,可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上對抗原、抗體反應(yīng)進行定性和定位研究或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進行定性和定量測定。目前抗體標記技術(shù)己被廣泛用于醫(yī)學(xué)病理學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測定,常見的抗體標記技術(shù)包括酶標記法,生物素化標記法,熒光素標記法和膠體金標記法等。

常用的抗體標記技術(shù):

1.抗體的酶標記法
通過共價鍵經(jīng)適當(dāng)方法將酶聯(lián)結(jié)在抗體上,制成酶標抗體,再借酶對底物的特異催化作用,生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,這些有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀查,也可以用分光光度計測定,呈色反應(yīng)顯示了酶的存在,從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。
實驗中使用偶聯(lián)劑使酶與抗體結(jié)合,即通過應(yīng)用單、雙或多功能試劑,分別與大分子的抗體所存在的功能性基團發(fā)生反應(yīng),生成酶—抗體偶聯(lián)復(fù)合物。不同的酶—抗體復(fù)合物制備方法中,最廣泛應(yīng)用的戊二醛法,本法與其它偶聯(lián)方法相比,具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和,及實用面廣等長處。
酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體,其次要有良好的制備方法。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上,宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

1) 辣根過氧化物酶(HRP)
辣根過氧化物酶(HRP)標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基,加入抗體IgG后該醛基與 IgG氨基結(jié)合,形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合,在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了,用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。

2) 堿性磷酸酶(AKP)
堿性磷酸酶(AKP)用于標記抗體,常用戊二醛一步法,將酶和單抗混合,再加入適量戊二醛,使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結(jié)合,制備成結(jié)合物。該法簡便,但所得產(chǎn)物不均一,抗體活性損失大,酶標記率低。

2.抗體的生物素化標記
親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性,是理想的標記劑。一個抗體分子可偶聯(lián)數(shù)十個生物素或親和素分子,而親和素或生物素分子又可與酶或熒光素結(jié)合,從而組成一個生物放大系統(tǒng),顯著提高檢測的靈敏度。常用的有親和素--生物素標記法(Labeled avidin biotin,LAB)、親和素-生物素橋法(bridged avidin biotin, BAB)和親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(avidin biotin peroxid ase complex,ABC)。本實驗可使抗體或其它蛋白質(zhì)的ε-氨基通過手臂與酰化的生物素共價結(jié)合。其后,生物素化的分子可應(yīng)用酶標-親和素或熒光染料-鏈霉親和素復(fù)合物來檢測。

3.抗體的熒光標記法
熒光抗體標記技術(shù)是將熒光素以化學(xué)方法與特異性抗體共價結(jié)合,形成熒光素-蛋白質(zhì)結(jié)合物(即熒光標記抗體),此結(jié)合物仍保留著抗體活性,同時具有熒光素的示蹤作用。當(dāng)它與相應(yīng)的抗原特異結(jié)合后,借助于熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)明亮的特異熒光。實驗中常用異硫qing基熒光黃(fluorescein isothiocyanate, FITC)作為標記物,在堿性溶液中,F(xiàn)ITC上的化學(xué)基團異硫qing基(-N=C=S)與抗體蛋白自由氨基(主要是賴氨酸的ε-氨基)結(jié)合,形成熒光抗體,以測定細胞相應(yīng)抗原的存在。FITC具有很高的量子產(chǎn)量(發(fā)射光與吸收光的比值,0 .85),而且形成的偶聯(lián)物的穩(wěn)定性很好。FITC是應(yīng)用最廣的熒光染料,流式細胞儀就按FITC的特性,設(shè)計了激光波長為488 nm,很接近于FITC的最大激發(fā)波長492nm)。

4.免疫膠體金標記抗體及檢測抗原
膠體金是一種常用的標記技術(shù),是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù),有其獨特的優(yōu)點。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標記。同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能利用到。
膠體金在光鏡和電鏡中均為有效的標記物,可以檢測單一和多重抗原。膠體金在電解質(zhì)中不穩(wěn)定,但被蛋白質(zhì)包被的膠體金是穩(wěn)定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被膠體金,可作標記二抗進行免疫檢測,本方法應(yīng)用范圍廣,染色后的樣品可以長期保存。

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