G418溶液(geneticin, G418)又稱遺傳霉素，是一種氨基糖苷類抗生素, 是細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的抗性篩選試劑。G418能阻斷蛋白質(zhì)合成，對(duì)細(xì)菌、酵母、高等植物以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞均具有氨基糖苷類毒性，用于真核細(xì)胞從轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn601穩(wěn)定轉(zhuǎn)染新霉素(neo)抗性基因的選擇和維持。經(jīng)常用于基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面。 

遠(yuǎn)慕生物G418溶液經(jīng)過(guò)濾除菌，一般工作濃度為50～1000ug/ml不等，然而不同類型的細(xì)胞需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度。在具有相對(duì)穩(wěn)定基因組的細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)中，一旦篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株后，無(wú)需加入G418繼續(xù)培養(yǎng)。 




G418溶液(geneticin,20mg/ml)操作步驟（僅供參考）： 

1.由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同批次的G418的活性液不同，所以在篩選之前，需要確定G418的最佳篩選濃度，一般在50～1000μg/ml范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。

2.將細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，并稀釋到1000個(gè)/ml。 

3.加入不同量的G418 solution (20mg/ml)，選擇在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來(lái)進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。  

注意事項(xiàng)： 
a.盡量減少反復(fù)凍融的次數(shù)，以免失效。 
b.基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì), 所以篩選不能太早。 
c. 篩選也不宜太遲，一般要在轉(zhuǎn)染24h之后才開始加G418篩選。因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因
的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，最終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆。 

4. 隨著細(xì)胞代謝，G418的濃度和活性都會(huì)下降，應(yīng)每3~5天更換一次含有G418的篩選液，這時(shí)藥物濃度可以降至200μg/ml。 

5.加藥篩選約5～7天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，為了減少死亡細(xì)胞對(duì)陽(yáng)性克隆的不利影響以及增加陽(yáng)性克隆的得到率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。加藥后，在高倍鏡下，刮除陰性克隆，消化陽(yáng)性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)?；蛘哂锰篆h(huán)套住陽(yáng)性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)，最后再用有限稀釋法把陽(yáng)性克隆在96孔板中篩選。 

6. 一般經(jīng)過(guò)4周左右的篩選，得到的陽(yáng)性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒(méi)有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的，再次篩選往往是必不可少的，經(jīng)過(guò)2次以上的篩選之后才能找到遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。

7.盡量避免污染。 

8.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 



標(biāo)簽：G418溶液(geneticin,20mg/ml)