Q1: 熒光素的純度對(duì)實(shí)驗(yàn)有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲熒光素和螢火蟲熒光素之間有區(qū)別嗎？

A：二者之間沒有區(qū)別。

Q3: 如何溶解熒光素，其溶液穩(wěn)定嗎？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，熒光素鈉鹽溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

熒光素鈉鹽和鉀鹽的水溶液短期內(nèi)存放于-80℃，對(duì)實(shí)驗(yàn)效果沒有明顯影響。有實(shí)驗(yàn)證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會(huì)更穩(wěn)定些。

對(duì)于一些較為敏感的試驗(yàn)，為了控制試驗(yàn)中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應(yīng)液 。例如，低濃度的熒光素酶或者并非最適的反應(yīng)條件是需要高質(zhì)量的底物才能進(jìn)行反應(yīng) 。

Q4: 熒光素鈉鹽和熒光素鉀鹽有什么區(qū)別？

A：目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)二者在使用效果上的區(qū)別，僅在物理特征上有些小的差別，如熒光素鈉鹽溶解度會(huì)高于熒光素鉀鹽。但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究中，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: 熒光素鈉鹽，熒光素鉀鹽，和熒光素游離酸之間有什么區(qū)別？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml，同樣可用NaOH，KOH弱堿去調(diào)節(jié)溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過程中會(huì)更方便，尤其是在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，因其能夠溶解在水中，反應(yīng)毒性也會(huì)更小些。

Q6: 為什么溶解熒光素鈉鹽或者鉀鹽的時(shí)候需用不含Ca²⁺或?Mg²⁺離子的PBS，有無別的鹽溶液可用來溶解熒光素？

A：PBS，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS，常用來進(jìn)行生物學(xué)研究或者細(xì)胞相關(guān)研究。PBS/DPBS為等滲溶液，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無差別，只是通常情況下，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會(huì)抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關(guān)的離子。其他的鹽溶液也可用來溶解熒光素，但要避免溶液中的陽(yáng)離對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。

Q7: 熒光素酶的發(fā)光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后，能夠表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開始發(fā)光，10 min后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)，在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30 min后開始衰減，約3 h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15-35 min內(nèi)。其動(dòng)力學(xué)曲線如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內(nèi)，注射方法之間的區(qū)別是什么？

A：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內(nèi)。約1 min可擴(kuò)散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對(duì)于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對(duì)于腹腔注射來講，擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光較慢，持續(xù)發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于熒光素的尾部靜脈注射，擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過血腦屏障嗎？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達(dá)穩(wěn)定性如何？

A：通過穩(wěn)定篩選等過程，熒光素酶基因是能夠插到細(xì)胞染色體內(nèi)的。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光素酶也得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細(xì)胞才能持續(xù)表達(dá)熒光素酶。