客戶提供

    基因序列或蛋白質(zhì)氨基酸序列

    最終交付

    約4 μg含有目的片段的高純度凍干質(zhì)粒DNA；

    含有重組質(zhì)粒的穿刺菌一管（TOP10）；

    發(fā)貨文件主要包括如下內(nèi)容：測序結(jié)果、COA報(bào)告、sqd文件。

    備注：默認(rèn)合成克隆基因至pUC57載體

    鄭重承諾：對客戶提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的結(jié)果沒有所有權(quán)，并承諾對結(jié)果嚴(yán)格保密，且不會以任何形式散布到第三方。

    載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：

    1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

    2、載體的類型：

    （1）克隆載體的克隆能力—據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。

    ①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。

    ②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有的其他抗性基因或報(bào)告基因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個(gè)單位數(shù)量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進(jìn)行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度。

    ③AAV的總包裝容量是4.7 kb（包含載體中兩個(gè)ITR約0.3kb +具體啟動子 + 內(nèi)含子約0.6kb + 具體熒光標(biāo)簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。

    （2）確定表達(dá)蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達(dá)質(zhì)粒。一般分為原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達(dá)載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達(dá)載體一般是細(xì)胞、體內(nèi)表達(dá)等需要時(shí)所用，只需要將它放到細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞即可，唯一考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達(dá)效率較高，也有多種啟動子經(jīng)過改造的表達(dá)載體，一般用來表達(dá)需要調(diào)控表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量的蛋白。

    3、載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。

    ①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

    ②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)；

    ③必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；

    ④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。