通過免疫熒光對樣本進(jìn)行染色，整個流程和化妝（護(hù)膚、妝前乳、底妝、彩妝，和定妝）一樣，有五個步驟。免疫熒光染色是如何一步步實(shí)現(xiàn)「化妝」的呢？小博同學(xué)下面會一一分解（藍(lán)孩子們，聽到「化妝」不要打瞌睡嘛，這可是關(guān)乎你們畢業(yè)大計(jì)的寶貴知識哦）。
「基礎(chǔ)護(hù)膚」--固定樣本
和基礎(chǔ)護(hù)膚的目的一樣，固定的目的就是為了長久保持細(xì)胞的狀態(tài)，讓樣本「容顏永駐」，「宛如生時(shí)」。
通過化學(xué)試劑處理樣本，從而固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白分布。免疫熒光的固定劑可以分為交聯(lián)類固定劑和有機(jī)溶劑類固定劑。交聯(lián)類固定劑大多采用的是甲醛、多聚甲醛等醛類物質(zhì)，這一類固定劑通過醛基與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成網(wǎng)絡(luò)，保持蛋白質(zhì)的位置和結(jié)構(gòu)，是最常用的固定劑。在少數(shù)情況下，可能會用到有機(jī)溶劑類固定劑，如甲醇、丙酮等。它們是通過變性蛋白質(zhì)的方式對組織進(jìn)行固定。具體使用何種樣本固定劑，可查看特定的抗體說明書。（圖 1） 「妝前乳」——通透細(xì)胞膜
固定好樣本的「容貌」之后，為了幫助「化妝品」進(jìn)入細(xì)胞，貼合抗原，需要進(jìn)行細(xì)胞膜通透的步驟。
通透，就是在細(xì)胞膜上打孔，使封閉液和抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞。一般情況下，采用醛類固定劑固定的樣本需通透細(xì)胞膜，而有機(jī)溶劑類固定劑本身就可以通透細(xì)胞膜，固定后的細(xì)胞不需要再增加通透步驟。通透一般采用表面活性劑 Triton-XTM 100，少數(shù)情況下，采用甲醇作為通透劑會得到更好的染色效果。抗體說明書上會標(biāo)注出合適的通透劑。（圖 2） 「底妝」——封閉抗體非特異性結(jié)合位點(diǎn)
「底妝」是為了遮蓋皮膚的瑕疵，保證后續(xù)「妝容」的清爽干凈。免疫熒光里，抗體的非特異性結(jié)合會導(dǎo)致樣本的「妝容」出現(xiàn)瑕疵，需要用「封閉液」上點(diǎn)「底妝」「遮瑕」——封閉掉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉液一般采用與二抗同來源的血清。
作為「底妝」的封閉液雖然常常扮演幕后英雄的角色，不引人注意，但是，如果封閉液質(zhì)量不好，孵育抗體之后很可能出現(xiàn)很多雜點(diǎn)，輕則影響美觀，重則掩蓋抗體的特異性信號，毀掉整個免疫熒光樣本。而 Troubleshooting 的時(shí)候往往會先從抗體上找原因，兜兜轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換了好多抗體也得不到滿意的結(jié)果，白白浪費(fèi)很多時(shí)間。所以，不要小看「底妝」對「妝容」的影響，慎選封閉液才能保證「妝容」通透干凈。
「彩妝」——孵育一抗/二抗、細(xì)胞核復(fù)染
經(jīng)過前面一系列的處理，我們的「模特」已經(jīng)擁有了無瑕的美肌。下面，讓我們期待「模特」的「彩妝」大變身。
化妝時(shí)，需「彩妝」修飾妝容，免疫熒光中，則是用抗體標(biāo)記樣本的特點(diǎn)，并添加絢麗的色彩。其中，一抗用來識別樣本中的抗原，定位「彩妝」，二抗用來放大信號、增加色彩。
一抗
一抗決定「彩妝」的定位，其特異性和靈敏度是免疫熒光成功與否的關(guān)鍵。如果一抗靈敏度不高，不能體現(xiàn)樣本的「上妝」效果，如果特異性不強(qiáng)，「妝容」就會臟兮兮的，哪哪兒都是。更有特異性差的抗體，明明應(yīng)該識別核蛋白，卻在胞質(zhì)里玩的不亦樂乎，使整個熒光結(jié)果「面目全非」。
去哪里才能找到最合適免疫熒光一抗呢？小博經(jīng)過多年苦心驗(yàn)證，吐血推薦 CST！！！這里的抗體質(zhì)量穩(wěn)定，靈敏度高、特異性強(qiáng)，是免疫熒光成功的不二法門。（圖 3） 二抗
有的一抗偶聯(lián)了熒光基團(tuán)，可以直接為免疫熒光的樣本提供絢麗的色彩（圖 4）。但是更多的情況下，一抗不帶有熒光標(biāo)記，需要偶聯(lián)熒光基團(tuán)的二抗與一抗結(jié)合，放大樣本信號，并且添加耀眼的「彩妝」效果（圖 5）。 選擇二抗時(shí)除了要與一抗匹配之外，還要考慮熒光基團(tuán)的顏色、穩(wěn)定性等因素對成像效果的影響。
1）熒光基團(tuán)的顏色：每一個熒光基團(tuán)都有它特定的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，選擇熒光基團(tuán)的時(shí)候，既要考慮實(shí)驗(yàn)的需求，也要考慮顯微鏡的光源和濾光片配置。常見熒光基團(tuán)的激發(fā)光和發(fā)射光如下（表 1）所示： 2）熒光基團(tuán)的穩(wěn)定性：熒光基團(tuán)長時(shí)間暴露在光下（尤其是顯微鏡的汞燈、激光器等強(qiáng)光源下），容易發(fā)生淬滅。好不容易做好的片子，剛剛在顯微鏡下調(diào)好視野準(zhǔn)備拍照，熒光信號就淬滅了，這種感覺就好像花了一早晨時(shí)間畫了個美美的妝，結(jié)果剛出門就趕上一場大雨，「脫妝」了，實(shí)在太讓人沮喪了。
為了防止「脫妝」，建議選用 Alexa Fluor??系列或 DyLight??系列的熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗體。這類熒光基團(tuán)具有更強(qiáng)的信號強(qiáng)度，更好的光穩(wěn)定性，耐受更廣泛的 pH 范圍，可以很好地減少熒光淬滅。目前，CST 用于免疫熒光的二抗，都是 Alexa Fluor??系列基團(tuán)標(biāo)記的。
細(xì)胞核復(fù)染
用抗體對樣本上完「彩妝」之后，還可以復(fù)染細(xì)胞核對「妝容」進(jìn)行修飾。復(fù)染的染料也有多種選擇（表 2）。
復(fù)染可以在二抗孵育后單獨(dú)進(jìn)行，也可以采用含有 DAPI 的封片劑直接封片 (#8961)，省略單獨(dú)復(fù)染的步驟。 「定妝」——封片
「彩妝」上完后，不要著急進(jìn)影棚拍片，還需上點(diǎn)「定妝液」，防止「脫妝」。
免疫熒光樣本的「定妝液」是防熒光淬滅的封片液，當(dāng)然推薦 CST 的 ProLong?? Gold Antifade Reagent (#8961，#9071)，它對熒光淬滅具有很好的抑制效果，可以保持「彩妝」持久靚麗。使用這種封片液時(shí)，蓋好蓋玻片后記得將載玻片放在黑暗處固化 24 hr，達(dá)到最佳的防淬滅效果。之后，就可以涂上美美的指甲油進(jìn)行封片啦。（圖 6） 以上，就是一個樣本小「模特」成功進(jìn)階為免疫熒光界的「吉賽爾·邦臣」的「化妝」大法，有了美艷的「超模」，再配上一點(diǎn)點(diǎn)拍照技巧，您期待的「美艷不可方物」的免疫熒光大片就呼之欲出了。