高通量測序（NGS）的原理
2016-09-30 1:11 作者：洛辰 來源：上海遠慕生物試劑
高通量測序（NGS）的原理
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高通量測序（High-Throughput Sequencing）又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對于傳統的桑格測序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量測序的主要平臺代表有羅氏公司(Roche)的454測序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer）。
Solexa的測序原理是可逆終止化學反應。DNA片段加上接頭之后，可以隨機的附著于玻璃表面（Flow cell），并且在固相的表面經過橋式擴增。這樣就形成了數千份相同的單分子簇，被用做測序模板。測序采取邊合成邊測序的方法，和模板配對的ddNTP原料被添加上去，不配對的ddNTP原料被洗去，成像系統能夠捕捉熒光標記的核苷酸。隨著DNA 3'端的阻斷劑的去除，下一輪的延伸就可以進行。和焦磷酸測序不同，每次DNA的只能延伸一個核苷酸。Solexa的讀長在100-150bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學研究。
ABI Solid技術的核心是4種熒光標記寡核苷酸的連接反應測序。測序之前，DNA模板通過乳化PCR擴增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉淀在玻片上。連接測序所用的底物是8個堿基熒光探針混合物，根據序列的位置，樣品DNA就可以被探針標記。DNA連接酶優先連接和模板配對的探針，并引發該位點的熒光信號的產生。Solid的讀長只有50-75bp，精確度可達Q40，適于基因組重測序和SNP檢測。
三個廠家的高通量測序儀器雖然各具特點，在原理上很多的共同之處：
1 將目標DNA剪切為小片段
2 單個小片段DNA分子結合到固相表面
3 單分子獨立擴增
4 每次只復制一個堿基（A,C,T,G）并檢測信號
5 高分辨率的成像系統
高通量測序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學信息，而且使得測序的費用和時間大大縮短。在高通量測序發展的過程中，也有很多的問題需要我們去解決：數據在臨床診斷上的作用，測序數據的儲存和分析，數據的安全和信息隱私等。
![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
