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![雙[三(羥甲基)氨基甲烷],CAS:6976-37-0](http://struc.chem960.com/strucimg/7000/ctzw0nzi34oyob9fnlmhiwee.png)
PCR技術可用于：（1）檢驗感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態；（2）有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量
PCR技術
| 實驗方法原理 |
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備； ②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
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| 實驗材料 |
模板DNA
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| 試劑、試劑盒 |
dNTP Taq DNA聚合酶 蒸餾水 PCR緩沖液 引物 氯化鎂
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| 儀器、耗材 |
PCR儀 移液槍 PCR板 薄壁管 離心管 離心管盒
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| 實驗步驟 |
展開
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| 注意事項 | |
| 其他 | 一、 PCR反應的關鍵環節 1. 模板核酸的制備。 2. 引物的質量與特異性。 3. 酶的質量。 4. PCR循環條件。 二、 PCR常見問題及對策 1. 假陰性，不出現擴增條帶
（1）模板原因
① 模板中含有雜蛋白質。 ② 模板中含有Taq酶抑制劑。 ③ 模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。 ④ 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。 ⑤ 模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。 （2）酶失活
① 需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。 ② 忘加Taq酶或溴乙錠。 （3）引物
① 引物質量。 ② 引物的濃度。 ③ 兩條引物的濃度是否對稱。 解決對策： ① 選定一個好的引物合成單 位。 ② 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 ③ 引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。 ④ 引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 （4）Mg2+濃度
① 濃度過高降低PCR擴增的特異性。 ② 濃度過低影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 （5）反應體積的改變
① 通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定; ② 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 （6）物理原因
① 變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性。 ② 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。 ③ 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度有問題。 （7）靶序列變異
① 靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合。 ② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。 2. 假陽性，出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
（1）引物設計不合適
① 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。 ② 靶序列太短或引物太短。 （2）靶序列或擴增產物的交叉污染
① 整個基因組或大片段的交叉污染。 解決方案：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 ② 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生。 解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。 3. 出現非特異性擴增：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。
（1） 引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。 （2） Mg2+離子濃度過高。 （3） 退火溫度過低。 （4） PCR循環次數 過多有關。
（5） 酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。 其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。 4. 出現片狀拖帶或涂抹帶
（1）原因
① 酶量過多。 ② 酶的質量差。 ③ dNTP濃度過高。 ④ Mg2+濃度過高。
⑤ 退火溫度過低。 ⑥ 循環次數過多引起。 （2）對策 ① 減少酶量。 ② 調換另一來源的酶。 ③ 減少dNTP的濃度。 ④ 適當降低Mg2+濃度。 ⑤ 增加模板量。 ⑥ 減少循環次數。 |