（一）實驗目的：學習細菌的簡單染色法和革蘭氏染色法。

    （二）實驗原理：用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。堿性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常采用堿性染料（如美藍、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。酸性染料的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。

    簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。

    革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。

    該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。

    （三）實驗器材

    1、活材料：培養12-16h的蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養24小時的大腸桿菌（Escherichiacoli）

    2、染色液和試劑：結晶紫（附二、（一）、3）、盧哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃紅（附二、（一）、5）、復紅（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油

    3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡

    （四）實驗方法：

    1、簡單染色：

    （1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，左邊涂蘇云金桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的蘇云金桿菌濃菌液挑2-3環涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取2-3環涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。

    （2）晾干：讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文火烘干。

    （3）固定：手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）

    （4）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色1-2min。

    （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液

    （6）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。

    （7）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌的形態。

    2、革蘭氏染色：

    （1）涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。

    （2）晾干：與簡單染色法相同。

    （3）固定，與簡單染色法相同

    （4）結晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1分鐘。

    （5）水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。

    （6）媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。

    （7）水洗：用水洗去碘液。

    （8）脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色，立即水洗。

    （9）復染：滴加蕃紅復染5min。

    （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。

    （11）晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。

    （12）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應性。

    （13）實驗完畢后的處理：

    ①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。

    ②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈。

    （五）實驗作業

    給出Bacillusthuringiensis和Escherichiacoli的形態圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應性。

    （六）注意事項

    1.革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。

    2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

    3.選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h，E.coli培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。